UN analisi funzionale delle proteine del vemone varanide e sporco ecologia.
Queste informazioni sulla ricerca mi sono state fornite direttamente dall'autore Alexandra Matossian per aver avviato il sito correttamente. Grazie mille a lei e Matt McDowell @Arboreal Obsurcities! Guarda un breve video di presentazione anche di A. Matossian nella sezione media sotto la ricerca Venomus.
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Proposta di sovvenzione NSF
Matossiano -
Proposta preliminare IOS: un'analisi funzionale delle proteine del veleno dei varanidi e dell'ecologia alimentare.
Quadro concettuale e obiettivi specifici
In precedenza si pensava che i draghi di Komodo, la più grande delle lucertole monitor, possedessero bocche infestate da batteri, causando avvelenamento del sangue e mortalità nelle loro prede. Tuttavia, i ricercatori hanno esaminato ampiamente Varanus komodoensis e hanno scoperto ghiandole velenifere avanzate nella mascella inferiore (Fry et al., 2009). È stato dimostrato che anche altri varanidi possiedono ghiandole velenifere; V. acanthurus, V. mitchelli, V. panoptes rubidus e V. varius. È stato anche dimostrato che i morsi di V. griseus e V. scalaris sono coerenti con i sintomi di avvelenamento (Sopiev et al., 1987, Ballard & Antonio, 2001). Nonostante la presenza di ghiandole velenifere, i varanidi mancano del sistema specializzato di rilascio della dentizione che è presente in altri membri del clade toxicofera proposto, Serpentes e Heloderma (Fry et al., 2006). I varanidi possiedono anche diversi mezzi di predazione e difesa, come frustare la coda contro gli attaccanti o usare la bocca e gli artigli per sottomettere la preda (Fry et al., 2009).
È stato dimostrato che la dieta gioca un ruolo importante nell'evoluzione della variabilità del veleno (Barlow et al., 2009). Anche i cambiamenti ontogenetici nella dieta possono causare cambiamenti nella composizione del veleno, come si vede in B. jacara, che si nutre principalmente di ectotermi da giovane ed endoterme da adulto; questo non si vede in B. alternatus che preda quasi interamente di endoterme per tutta la sua vita (Andrade e Abe, 1999). I varanidi variano notevolmente nella dieta: la stragrande maggioranza del genere è carnivora, ma ci sono diversi frugivori (V. olivaceus, V. bitatawa) e altri specialisti come V. dumerilli, che si nutrono prevalentemente di crostacei (Brandenburg, 1983). Pertanto, è ragionevole suggerire la possibilità che la composizione del veleno di varanid vari anche in base alla dieta.
Questa ricerca proposta si concentrerà principalmente sulla funzione ecologica del veleno di varanid. La funzione principale del veleno è aiutare nella predazione? Mi concentrerò sull'esplorazione del proteoma velenoso di tre specie di varanid disponibili negli Stati Uniti: V. acanthurus, V. panoptes horni, la sottospecie di V. panoptes della Nuova Guinea e V. salvadorii, il parente più prossimo di V. komodoensis. Ciò sarà fatto raccogliendo dati da HPLC, sequenziamento N-terminale, spettrometria di massa e utilizzando l'analisi BLAST per determinare le famiglie proteiche note presenti nel veleno di varanid. Questa ricerca cerca anche di comprendere il ruolo che la dieta gioca nella determinazione delle caratteristiche del veleno: il veleno dei varanidi varia in base alla specie rispetto alle sue prede preferite? L'analisi della dieta dei serpenti che possiedono le stesse proteine nel loro veleno sarà confrontata con la dieta di ciascuna specie di varanide.
Fondamento logico
È stato dimostrato che le specie che sviluppano altri mezzi di predazione (p. es., costrizione) o sviluppano una dieta ovofaga, subiscono una rapida degenerazione delle ghiandole velenifere e del sistema di rilascio del veleno a causa dell'elevato costo energetico della produzione del veleno (Fry et al., 2012 ). Data la dimensione delle ghiandole e la produzione di veleno di V. komodoensis e V. varius, la loro biologia sostiene che il veleno ha una funzione importante ((Barlow et al., 2009). Inoltre, è stata studiata la complessità delle ghiandole velenifere di Komodo; il specie possiede ghiandole sierose lungo la mascella inferiore, che hanno lumina centrale e dotti che portano alle basi dei denti.Questo studio ha anche documentato la diversità delle tossine presenti nel veleno di V. komodoensis, tra cui AVIT, CRISP, callicrein, natriuretic e PLA2, che principalmente causare ipotensione, anticoagulazione, stimolazione dell'infiammazione e paralisi della muscolatura liscia (Fry et al., 2012).
Le lucertole monitor scuotono spesso la testa, devastano l'oggetto da preda con i loro artigli e altrimenti lo traumatizzano per sottomettere l'animale; il semplice fatto che la lucertola morda un oggetto da preda non fornirà dati utili sull'efficacia del veleno. Ad esempio, V. komodensis possiede denti grandi e seghettati e impiega una strategia di presa e strappo che infligge profonde ferite parallele a grandi prede oltre all'avvelenamento. È importante notare che questa è una componente importante del comportamento di predazione delle lucertole monitor, nella misura in cui il veleno può essere efficace solo quando la preda sta già subendo un trauma fisico e una perdita di sangue date le sue proprietà anticoagulanti e ipotensive già menzionate (Fry et al. , 2009).
Ipotesi
Domanda 1: Perché i varanidi possiedono ghiandole velenifere avanzate? Q1 Ipotesi 1: La funzione principale del veleno di varanid è di aiutare nella predazione attraverso fattori proteici anticoagulanti e induzione dello shock. Questa analisi prevede che il veleno possieda fattori anticoagulanti che dovrebbero aumentare funzionalmente il flusso sanguigno della preda attraverso le lesioni inflitte dal monitor e possono anche ridurre la pressione sanguigna. Prevediamo anche che i varanidi frugivori possiedano ghiandole velenifere degenerate.
Domanda 2: come e perché il veleno di varanid differisce nella composizione tra le specie? Q2 Ipotesi 1: proteine tossiche specifiche nel veleno di varanid si sono evolute selettivamente per essere più efficaci sulla loro preda preferita. Pertanto, il veleno varierà tra i varanidi che differiscono in modo significativo nella dieta. Ne consegue anche che il veleno di varanid può avere effetti diversi su specie diverse, essendo più efficace su ciò che preda più comunemente. Saranno analizzate molteplici osservazioni in situ della dieta dei varanidi e confrontate con altre raccolte di predazione delle lucertole monitor al fine di valutare quale specie di preda ciascuna specie di varanide predilige maggiormente. Q2 Ipotesi 2: La variazione geografica e la speciazione hanno consentito la diversificazione delle proteine del veleno. Le popolazioni di Crotalus scutulatus scutulatus producono diversi tipi di veleno in base alla loro variazione geografica e, dove gli intervalli si integrano, risulta un terzo tipo di veleno (Glenn & Straight, 1989). Questa ipotesi prevede che maggiore è la differenza geografica ed evolutiva, maggiori saranno le differenze nella composizione e nelle concentrazioni del veleno. Saranno necessarie più specie di varanidi per concludere differenze significative basate sulla geografia, ma per questa ricerca, V. acanthurus è sufficientemente distante dall'Australia nordoccidentale, lontano da V. panoptes horni e V. salvadorii che si sovrappongono nella gamma meridionale della Nuova Guinea. I dati di V. panoptes horni e V. salvadorii saranno analizzati per il grado di parentela rispetto a V. acanthurus.
Progetto di ricerca
Estrazione del veleno
Non esiste un protocollo standard per l'estrazione del veleno nei varanidi, quindi seguirò le linee guida per l'estrazione del veleno di Heloderma, con alcune modifiche per compensare le differenze fisiologiche dei varanidi.
Le lucertole vengono maneggiate in sicurezza con il minimo rischio di lesioni al detentore e all'animale afferrando saldamente l'animale alla base del collo e delle spalle. Questo viene fatto per gli animali più piccoli mettendo il collo tra il medio e l'anulare mentre si avvolge il pollice e per gli animali più grandi avvolgendo una mano attorno al collo. Quindi l'animale viene afferrato per la base della coda e sollevato in aria, sostenuto dalla mano sul collo e sul petto, mentre l'altra mano tiene sotto i fianchi e le zampe posteriori. La lucertola viene quindi avvicinata al corpo, con la coda premuta tra il braccio e l'addome, o tra le gambe. Se la coda non è assicurata, la lucertola rischia di ferirla con fruste difensive per liberarsi.
Le lucertole vengono indotte a mordere ripetutamente su un tubo di gomma morbida (un capezzolo sterilizzato utilizzato per la mungitura dei vitelli è stato segnalato come molto efficace dal Kentucky Reptile Zoo) verso la parte posteriore della bocca, e le ghiandole velenifere vengono quindi massaggiate delicatamente per facilitare il rilascio di veleno che successivamente verrà pipettato direttamente dalla bocca. I varanidi hanno solo ghiandole velenifere nella mascella inferiore, quindi la pipetta attirerà da quella regione della bocca. Un po' di veleno può anche accumularsi nel tubo, quindi il processo viene eseguito su un tradizionale meccanismo di raccolta del veleno per i serpenti per garantire che tutto il veleno venga catturato nel processo.
È stato dimostrato che il veleno del serpente a sonagli non è in gran parte influenzato dalle condizioni di conservazione che variano fino a 117°C. Pertanto, la temperatura a cui viene conservato il veleno non è qualcosa di cui ci preoccupiamo molto, e quindi stiamo conservando il veleno a temperatura ambiente.
Allevamento in cattivitÃ
Il veleno richiede energia per essere prodotto, quindi i varanidi che vengono munti per il loro veleno devono essere nutriti bene per garantire che non vi sia alcun calo delle condizioni corporee a causa dello stress o dell'aumento del metabolismo dovuto alla produzione di veleno. Ogni individuo viene estratto al massimo ogni 14 giorni. Sono alimentati in modo vario dieta per prede intere congelate e scongelate che imita ciò di cui prederebbero in natura, con cibo offerto dopo l'estrazione e altrimenti a giorni alterni.
Le lucertole saranno mantenute in recinti che hanno temperature, arredi, umidità , precipitazioni e cicli di luce (inclusi UVA/UVB) che imitano il loro ambiente naturale. Ogni specie avrà i suoi bisogni appositamente soddisfatti in base alla variazione geografica e ai requisiti e manterrà costante in tutti gli individui della stessa specie. Gli individui sono alloggiati in recinti separati che misurano almeno una lunghezza del corpo di larghezza e due lunghezze del corpo alte e lunghe. Le specie terrestri fornivano un minimo di 18 pollici di terra per consentire il corretto ciclismo delle femmine e per aiutare a mantenere l'umidità , nonché per arricchire e sostenere i comportamenti naturali. L'acqua dolce è sempre disponibile. Ad ogni animale viene data una vasca abbastanza grande da potersi immergere completamente, e questa viene cambiata ogni giorno. Tutti gli animali sono sessualmente maturi. La manipolazione sarà ridotta al minimo per ridurre lo stress sull'animale, ma la manutenzione della gabbia sarà eseguita quotidianamente.
Test
Per verificare l'ipotesi che il veleno aiuti a rendere inabili le prede, il veleno sarà raccolto da tre specie di varanidi. V. acanthurus, V. panoptes horni e V. salvadorii sono stati selezionati per la disponibilità negli Stati Uniti, soprattutto come esemplari allevati in cattività , e per la netta variazione tra le specie nonostante fossero tutte lucertole monitor indo-australiane (Fitch et al , 2006). V. acanthurus è una specie di monitor terrestre nana proveniente dall'Australia che si nutre principalmente di insetti; V. panoptes horni è un monitor terrestre di medie dimensioni della Nuova Guinea e un predatore generalista sia sui vertebrati che sugli invertebrati allo stesso modo; V. salvadorii è una grande lucertola arborea, anch'essa della Nuova Guinea, che si nutre quasi esclusivamente di uccelli, uova e mammiferi (Arbuckle, 2009).
L'analisi tossicologica sarà effettuata sul veleno grezzo raccolto da queste specie. Le tossine saranno isolate per determinare quali sono condivise tra le specie di varanidi e altri rettili velenosi. Al momento dell'estrazione, verranno effettuate misurazioni relative alla quantità di veleno, al peso corporeo e all'SVL (lunghezza dal muso allo sfiato). Verrà eseguita un'analisi comparativa mediante l'uso di test ANOVA. Questo per determinare se c'è qualche differenza nel veleno all'interno di una specie, in particolare in base alle dimensioni, poiché le lucertole monitor predano oggetti diversi durante la loro vita. Tuttavia, tutte le lucertole monitor utilizzate in questo studio sono adulti sessualmente maturi.
Il test del proteoma del veleno verrà eseguito con queste tre specie note per possedere ghiandole velenifere, raccogliendo il veleno ed eseguendo analisi velenifere. Ciò inizierà con l'analisi del veleno grezzo utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa (HPLC). Ciascuna frazione proteica sarà caratterizzata mediante sequenziamento N-terminale e determinazione spettrometrica di massa delle masse molecolari e del contenuto di cisteina. Le proteine con una singola sequenza N-terminale, massa molecolare e una singola banda elettroforetica saranno caratterizzate mediante analisi BLAST. Dall'analisi BLAST, dovrebbe essere distinguibile una famiglia proteica nota, a meno che i varanidi non possiedano nuove tossine, il che va oltre lo scopo di questa ricerca prevista. Questo approccio ha consentito il sequenziamento e l'analisi avanzati del veleno di serpente (Bazaa et al., 2005, Calvete et al., 2007). Verranno eseguite ANOVA per determinare se vi è una variazione significativa tra le tossine presenti in ciascuna delle tre specie.
Verranno eseguite ulteriori analisi per isolare la preda più colpita dal veleno di ciascuna specie e vedere se corrisponde alle osservazioni della dieta naturale di quella specie. Questo sarà estrapolato dal confronto delle proteine note del veleno di serpente e dei loro effetti su varie specie alle proteine trovate tramite l'analisi BLAST nel veleno di varanid.
Nel complesso, cerco di analizzare e sequenziare le proteine presenti nel veleno di varanid. Cercherò anche di analizzare le possibili connessioni tra le tossine specie-specifiche, la loro relativa abbondanza e le specie prede preferite dai varanidi.
Impatti più ampi del lavoro proposto
Se non vi è alcun effetto significativo del veleno di varanid su nessuno dei suoi tipi di preda, sono necessari ulteriori test per determinare quale sia la funzione ecologica del veleno nelle lucertole monitor, se non per aiutare nella predazione. Alcuni ricercatori hanno affermato che a causa della natura fisica aggressiva della predazione dei varanidi, probabilmente non esiste uno scopo ecologico per i varanidi che possiedono il veleno (Sweet, 2016). Questo è ancora significativo, poiché potremmo quindi essere in grado di osservare la degenerazione delle ghiandole velenifere energeticamente costose. Testarlo per le proprietà antimicrobiche/antiparassitarie, nonché per eventuali enzimi e proprietà digestive, è un'ulteriore ricerca che deve essere svolta indipendentemente dai risultati di questo studio. Nei viperidi, negli elapidi e nei colubridi, il veleno ha molteplici funzioni, quindi è probabile che svolga molteplici funzioni anche per Varano.
Se c'è un effetto significativo del veleno di varanid su uno qualsiasi dei suoi tipi di prede, è significativo in diversi modi. In primo luogo, fornisce ulteriore supporto al proposto clade Toxicofera, il che suggerisce che tutti i rettili discendono da un comune antenato squamato produttore di veleno. La filogenetica dei rettili è in continua evoluzione, quindi questa ricerca fornisce ulteriori prove per supportare o confutare la teoria. In secondo luogo, mostra che le secrezioni orali biochimiche degli squamati richiedono ulteriori studi, poiché solo di recente è stato proposto che i membri dei Varanidae possiedano il veleno anziché solo bocche infestate da batteri. In terzo luogo, ha implicazioni sul commercio di animali domestici, poiché tutti gli stati hanno regolamenti sulla custodia privata dei serpenti velenosi, ma i varanidi sono meno regolamentati e più comunemente tenuti. Infine, questa ricerca può aiutare ad aprire le possibilità di utilizzare il veleno di varanid come tecnologia medica. Captopril e Tirofiban sono rispettivamente ACE-inibitori e farmaci antipiastrinici, che sono stati isolati dal veleno di Bothrops jararaca ed Echis carinatus. Credo che il veleno di varanid possa anche possedere tossine che possono essere utilizzate per creare farmaci terapeutici e prodotti farmaceutici che migliorano la vita umana.
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