SEBUAH  analisis fungsional protein vemon varanid dan  kotor  ekologi. 

Informasi penelitian ini telah diberikan kepada saya langsung dari penulis Alexandra Matossian atas nama memulai situs web dengan benar. Terima kasih banyak untuknya dan Matt McDowell @Arboreal Obsurcities! Lihat juga presentasi video singkat oleh A. Matossian di bagian media di bawah penelitian Venomus.

​

Proposal Hibah NSF

Matossia -

Proposal Awal IOS: Analisis fungsional protein racun varanid dan ekologi makanan.

Kerangka Konseptual dan Tujuan Khusus

Komodo, kadal monitor terbesar, sebelumnya dianggap memiliki mulut yang dipenuhi bakteri, menyebabkan keracunan darah dan kematian pada mangsanya. Namun, para peneliti telah memeriksa Varanus komodoensis secara ekstensif, dan menemukan kelenjar racun tingkat lanjut di rahang bawah (Fry et al., 2009). Varanid lain juga telah terbukti memiliki kelenjar racun; V. acanthurus, V. mitchelli, V. panoptes rubidus, dan V. varius. Gigitan V. griseus dan V. scalaris juga telah terbukti konsisten dengan gejala keracunan (Sopiev et al., 1987, Ballard & Antonio, 2001). Meskipun terdapat kelenjar racun, varanid tidak memiliki sistem pengiriman gigi khusus yang ada pada anggota lain dari clade toxicofera yang diusulkan, Serpentes dan Heloderma (Fry et al., 2006). Varanids juga memiliki beberapa cara predasi dan pertahanan, seperti mencambuk ekor pada penyerang, atau menggunakan mulut dan cakar untuk menaklukkan mangsanya (Fry et al., 2009).

Telah terbukti bahwa diet memainkan peran utama dalam evolusi variabilitas racun (Barlow et al., 2009). Bahkan perubahan ontogenetik dalam makanan dapat menyebabkan perubahan komposisi racun, seperti yang terlihat pada B. jacara, yang terutama memakan ektoterm saat remaja dan endoterm saat dewasa; hal ini tidak terlihat pada B. alternatus yang hampir seluruhnya memangsa hewan endoterm sepanjang hidupnya (Andrade dan Abe, 1999). Varanids sangat bervariasi dalam diet: sebagian besar genus adalah karnivora, tetapi ada beberapa frugivora (V. olivaceus, V. bitatawa) dan spesialis lain seperti V. dumerilli, yang sebagian besar memakan krustasea (Brandenburg, 1983). Oleh karena itu, masuk akal untuk menyarankan kemungkinan komposisi racun varanid yang bervariasi menurut diet juga.

Penelitian yang diusulkan ini akan fokus terutama pada fungsi ekologis racun varanid. Apakah fungsi utama racun untuk membantu pemangsaan? Saya akan fokus pada eksplorasi proteom racun dari tiga spesies varanid yang tersedia di Amerika Serikat: V. acanthurus, V. panoptes horni, subspesies V. panoptes New Guinea, dan V. salvadorii, kerabat terdekat V. komodoensis. Ini akan dilakukan dengan mengumpulkan data dari HPLC, N-terminal sequencing, spektrometri massa, dan dengan menggunakan analisis BLAST untuk menentukan keluarga protein yang diketahui ada dalam racun varanid. Penelitian ini juga berusaha untuk memahami peran diet dalam penentuan karakteristik racun- apakah racun varanid bervariasi menurut spesies sehubungan dengan spesies mangsa yang disukainya? Analisis diet ular yang memiliki protein yang sama dalam bisanya akan dibandingkan dengan diet masing-masing spesies varanid.

Alasan

Telah ditunjukkan bahwa spesies yang mengembangkan cara pemangsaan lain (misalnya, penyempitan) atau mengembangkan pola makan ovofag, mengalami degenerasi kelenjar racun dan sistem pengiriman racun yang cepat karena tingginya biaya produksi racun (Fry et al., 2012). ). Mengingat ukuran kelenjar dan hasil racun V. komodoensis dan V. varius, biologi mereka berpendapat bahwa racun memiliki fungsi penting ((Barlow et al., 2009). Selanjutnya, kompleksitas kelenjar racun Komodo telah dipelajari; spesies memiliki kelenjar serosa di sepanjang rahang bawah, yang memiliki lumina pusat dan saluran yang mengarah ke dasar gigi.Penelitian ini juga mendokumentasikan keragaman racun yang ada dalam racun V. komodoensis, termasuk AVIT, CRISP, kallikrein, natriuretik, dan PLA2, yang terutama menyebabkan hipotensi, antikoagulasi, stimulasi inflamasi, dan paralisis otot polos (Fry et al., 2012).

Kadal monitor sering menggelengkan kepala, mencakar mangsanya dengan cakar, dan sebaliknya membuat trauma untuk menaklukkan hewan; membiarkan kadal menggigit mangsanya tidak akan memberikan data yang berguna sehubungan dengan kemanjuran racun.  Misalnya, V. komodensis memiliki gigi besar, bergerigi, dan menggunakan strategi mencengkeram dan merobek yang menimbulkan luka paralel yang dalam pada hewan mangsa besar selain envenomation. Penting untuk dicatat bahwa ini adalah komponen utama dari perilaku predasi biawak, sampai tingkat di mana racun hanya efektif ketika mangsa sudah mengalami trauma fisik dan kehilangan darah mengingat sifat antikoagulan dan hipotensi yang telah disebutkan (Fry et al. , 2009).

Hipotesis

Pertanyaan 1: Mengapa varanid memiliki kelenjar racun tingkat lanjut? Q1 Hipotesis 1: Fungsi utama racun varanid adalah membantu pemangsaan melalui faktor protein antikoagulasi dan induksi syok. Analisis ini memprediksi bahwa racun memiliki faktor antikoagulasi yang secara fungsional meningkatkan aliran darah mangsa melalui cedera yang ditimbulkan oleh monitor, dan juga dapat menurunkan tekanan darah. Kami juga memperkirakan bahwa varanid pemakan buah memiliki kelenjar racun yang mengalami degenerasi.

Pertanyaan 2: Bagaimana dan mengapa racun varanid berbeda dalam komposisi antar spesies? Q2 Hipotesis 1: Protein toksik spesifik dalam racun varanid telah berevolusi secara selektif menjadi yang paling efektif pada mangsa favorit mereka. Oleh karena itu, racun akan bervariasi antara varanid yang berbeda secara signifikan dalam makanan. Hal ini juga mengikuti bahwa racun varanid mungkin memiliki efek yang bervariasi pada spesies yang berbeda, yang paling efektif pada apa yang paling sering dimangsa. Beberapa pengamatan in-situ dari diet varanid akan dianalisis dan dibandingkan dengan kompilasi pemangsaan biawak lainnya untuk menilai spesies mangsa mana yang paling disukai setiap spesies varanid. Q2 Hipotesis 2: Variasi geografis dan spesiasi telah memungkinkan untuk diversifikasi protein racun. Populasi Crotalus scutulatus scutulatus menghasilkan berbagai jenis racun berdasarkan variasi geografis mereka, dan di mana rentangnya terintegrasi, jenis racun ketiga hasil (Glenn & Straight, 1989). Hipotesis ini memprediksi bahwa semakin besar perbedaan geografis dan evolusi, semakin banyak perbedaan dalam komposisi dan konsentrasi racun yang akan terjadi. Lebih banyak spesies varanid akan diperlukan untuk menyimpulkan perbedaan yang signifikan berdasarkan geografi, tetapi untuk penelitian ini, V. acanthurus cukup jauh dari Australia Barat Laut, jauh dari V. panoptes horni dan V. salvadorii yang tumpang tindih dalam jangkauan di selatan New Guinea. Data V. panoptes horni dan V. salvadorii akan dianalisis derajat kekerabatannya dibandingkan dengan V. acanthurus.

Desain penelitian

Ekstraksi Racun

Tidak ada protokol standar untuk ekstraksi racun dalam varanid, jadi saya akan mengikuti panduan untuk ekstraksi racun Heloderma, dengan beberapa modifikasi untuk mengimbangi perbedaan fisiologis varanid.

Kadal ditangani dengan aman dengan risiko cedera minimal pada penjaga dan hewan dengan menggenggam hewan dengan kuat di pangkal leher dan bahu. Ini dilakukan untuk hewan yang lebih kecil dengan meletakkan leher di antara jari tengah dan jari manis sambil melingkarkan ibu jari, dan untuk hewan yang lebih besar, dengan melingkarkan satu tangan di leher. Kemudian hewan itu dicengkeram oleh pangkal ekor dan diangkat ke udara, didukung oleh tangan di leher dan dadanya, sementara tangan lainnya memegang di bawah pinggul dan kaki belakang. Kadal tersebut kemudian ditarik mendekat ke tubuhnya, dengan ekor ditekan di antara lengan dan perut, atau di antara kaki. Jika ekornya tidak diamankan, kadal berisiko melukainya dengan cambuk pertahanan untuk membebaskan diri.

Kadal dibujuk untuk menggigit berulang kali pada tabung karet lembut (puting steril yang digunakan untuk memerah susu anak sapi telah dilaporkan sangat efektif oleh Kebun Binatang Reptil Kentucky) ke arah belakang mulut, dan kelenjar racun kemudian dipijat dengan lembut untuk memfasilitasi pelepasan racun yang selanjutnya akan dipipet langsung dari mulut. Varanid hanya memiliki kelenjar racun di rahang bawahnya, jadi pipet akan menarik dari daerah mulutnya. Beberapa racun juga dapat terkumpul di dalam tabung, jadi prosesnya dilakukan melalui mekanisme pengumpulan racun tradisional untuk ular untuk memastikan bahwa semua racun ditangkap dalam prosesnya.

Telah terbukti bahwa racun ular derik sebagian besar tidak terpengaruh oleh kondisi penyimpanan yang bervariasi hingga 117C. Oleh karena itu, suhu penyimpanan racun bukanlah sesuatu yang sangat kami khawatirkan, dan dengan demikian kami menyimpan racun pada suhu kamar.

Penangkaran

Racun membutuhkan energi untuk membuatnya, jadi varanid yang diperah untuk racunnya harus diberi makan dengan baik untuk memastikan tidak ada penurunan kondisi tubuh akibat stres atau peningkatan metabolisme dari produksi racun. Setiap individu diekstraksi dari maksimal setiap 14 hari. Mereka diberi makan yang bervariasi  diet mangsa utuh beku-cair yang meniru apa yang akan mereka mangsa di alam, dengan makanan yang ditawarkan setelah ekstraksi, dan sebaliknya setiap hari.

Kadal akan dipelihara di kandang yang memiliki suhu, perabotan, kelembaban, curah hujan, dan siklus cahaya (termasuk UVA/UVB) yang meniru lingkungan alami mereka. Setiap spesies akan memenuhi kebutuhannya secara khusus berdasarkan variasi dan persyaratan geografis, dan tetap konstan di semua individu dari spesies yang sama. Individu ditempatkan di kandang terpisah yang berukuran minimal satu panjang tubuh lebar, dan dua panjang tubuh tinggi dan panjang. Spesies darat menyediakan minimal 18” kotoran untuk memungkinkan siklus betina yang tepat dan untuk membantu menjaga kelembaban, serta untuk memperkaya dan mendukung perilaku alami. Air tawar tersedia setiap saat. Setiap hewan diberi bak yang cukup besar untuk ditenggelamkan sepenuhnya, dan ini diganti setiap hari. Semua hewan dewasa secara seksual. Penanganan akan dilakukan seminimal mungkin untuk mengurangi stres pada hewan, tetapi pemeliharaan kandang akan dilakukan setiap hari.

Pengujian

     Untuk menguji hipotesis bahwa racun membantu melumpuhkan mangsa, racun akan dikumpulkan dari tiga spesies varanid. V. acanthurus, V. panoptes horni, dan V. salvadorii dipilih karena ketersediaannya di Amerika Serikat, terutama sebagai spesimen hasil penangkaran, dan karena variasi yang berbeda antar spesies meskipun semuanya merupakan kadal monitor Indo-Australia (Fitch et al. , 2006). V. acanthurus adalah kerdil, spesies monitor terestrial dari Australia yang terutama memakan serangga; V. panoptes horni adalah monitor terestrial berukuran sedang dari New Guinea dan predator umum pada vertebrata dan invertebrata secara setara; V. salvadorii adalah kadal arboreal besar juga dari New Guinea yang memakan hampir secara eksklusif burung, telur, dan mamalia (Arbuckle, 2009).

Analisis toksikologi akan dilakukan pada racun mentah yang dikumpulkan dari spesies ini. Racun akan diisolasi untuk menentukan mana yang dibagi antara spesies varanid dan reptil berbisa lainnya. Setelah ekstraksi, pengukuran akan dilakukan sehubungan dengan jumlah racun, berat badan, dan SVL (panjang moncong ke ventilasi). Analisis komparatif melalui penggunaan pengujian ANOVA akan dilakukan. Ini untuk menentukan apakah ada perbedaan dalam racun dalam suatu spesies, terutama berdasarkan ukuran, karena kadal monitor memangsa item yang berbeda sepanjang hidup mereka. Namun, semua biawak yang digunakan dalam penelitian ini adalah kadal dewasa yang matang secara seksual.

     Pengujian proteom racun akan dilakukan dengan ketiga spesies yang diketahui memiliki kelenjar racun, dengan mengumpulkan racun dan melakukan analisis racun. Ini akan dimulai dengan analisis racun mentah menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik (HPLC). Setiap fraksi protein akan dikarakterisasi dengan N-terminal sequencing dan penentuan spektrometri massa massa molekul dan kandungan sistein. Protein dengan urutan N-terminal tunggal, massa molekul, dan pita elektroforesis tunggal akan dikarakterisasi menggunakan analisis BLAST. Dari analisis BLAST, keluarga protein yang diketahui harus dapat dilihat, kecuali varanid memiliki racun baru, yang berada di luar cakupan penelitian yang dimaksudkan ini. Pendekatan ini memungkinkan untuk pengurutan lanjutan dan analisis racun ular (Bazaa et al., 2005, Calvete et al., 2007). ANOVA akan dilakukan untuk menentukan apakah ada variasi yang signifikan antara racun yang ada di masing-masing dari tiga spesies.

     Analisis lebih lanjut akan dilakukan untuk mengisolasi mangsa yang paling terpengaruh oleh racun masing-masing spesies, dan melihat apakah itu cocok dengan pengamatan makanan alami spesies tersebut. Ini akan diekstrapolasi dengan perbandingan protein racun ular yang diketahui dan pengaruhnya pada berbagai spesies dengan protein yang ditemukan melalui analisis BLAST dalam racun varanid.

     Secara keseluruhan, saya berusaha menganalisis dan mengurutkan protein yang ada dalam racun varanid. Saya juga akan mencoba menganalisis kemungkinan hubungan antara racun spesifik spesies, kelimpahan relatifnya, dan spesies mangsa favorit varanid.

Dampak Lebih Luas dari Pekerjaan yang Diusulkan

     Jika tidak ada efek yang signifikan dari racun varanid pada salah satu jenis mangsanya, maka pengujian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan apa fungsi ekologis racun pada biawak, jika tidak untuk membantu pemangsaan. Beberapa peneliti berpendapat bahwa karena sifat fisik agresif dari predasi varanid, mungkin tidak ada tujuan ekologis untuk varanid yang memiliki racun (Sweet, 2016). Ini masih penting, karena kita kemudian dapat mengamati degenerasi kelenjar racun yang sangat mahal. Mengujinya untuk sifat antimikroba/antiparasit, serta untuk enzim dan sifat pencernaan apa pun, adalah penelitian lebih lanjut yang perlu dilakukan terlepas dari hasil penelitian ini. Dalam ular beludak, elapid, dan colubrids, racun memiliki banyak fungsi, jadi kemungkinan besar racun juga memiliki banyak fungsi untuk Varanus.

     Jika ada efek signifikan dari racun varanid pada salah satu jenis mangsanya, itu signifikan dalam berbagai cara. Pertama, ini memberikan dukungan tambahan untuk clade Toxicofera yang diusulkan, yang menunjukkan bahwa semua reptil berasal dari nenek moyang squamate penghasil racun yang sama. Filogenetik reptil terus berkembang, sehingga penelitian ini memberikan bukti lebih lanjut untuk mendukung atau membantah teori tersebut. Kedua, ini menunjukkan bahwa sekresi oral biokimia squamate memerlukan studi lebih lanjut, karena baru-baru ini telah diusulkan bahwa anggota Varanidae memiliki racun yang bertentangan dengan mulut yang dipenuhi bakteri. Ketiga, ini berimplikasi pada perdagangan hewan peliharaan, karena semua negara bagian memiliki peraturan tentang pemeliharaan pribadi ular berbisa, tetapi varanid kurang diatur dan lebih umum disimpan. Akhirnya, penelitian ini dapat membantu membuka kemungkinan penggunaan racun varanid sebagai teknologi medis. Captopril dan Tirofiban masing-masing merupakan ACE inhibitor dan obat antiplatelet, yang diisolasi dari bisa dari Bothrops jararaca dan Echis carinatus. Saya percaya bahwa racun varanid mungkin juga mengandung racun yang dapat digunakan untuk membuat obat terapeutik dan obat-obatan yang meningkatkan kehidupan manusia.

Daftar referensi

Andrade, D. & Abe, A. (1999). Hubungan Ontogeni Racun dan Diet di Bothrops. Herpetologi
55(2), 200-204.

Arbuckle, Kevin. (2009). Fungsi Ekologis Venom di Varanus, dengan Kompilasi
Catatan Diet dari Literatur. Biawak, Jurnal Biologi dan Peternakan Varanid, 3(2), 46-56.

Ballard, V. dan FB Antonio. (2001) Varanus griseus (pemantau gurun): toksisitas. Tinjauan Herpetologis 32: 261.

Barlow, A., Pook, CE, Harrison, RA, & Wuster, W. (2009). Koevolusi diet dan aktivitas racun spesifik mangsa mendukung peran seleksi dalam evolusi racun ular. Prosiding Royal Society B: Ilmu Biologi, 276(1666), 2443-2449 . doi:10.1098/rspb.2009.0048

Bazaa, A., Marrakchi, N., Ayeb, ME, Sanz, L., & Calvete, JJ (2005). Racun ular: Analisis komparatif dari proteom racun ular Tunisia; Cerastes cerastes, Cerastes vipera dan Macrovipera lebetina. Proteomik, 5(16), 4223-4235 . doi:10.1002/pmic.200402024

Brandenburg T. (1983). Pengawas Kepulauan Indo-Australia. M.Sc. Skripsi, Universitas Leyden, Belanda.

Calvete, JJ, Juárez, P., & Sanz, L. (2007). Racun ular. Strategi dan aplikasi. Jurnal Spektrometri Massa, 42(11), 1405-1414. doi:10.1002/jms.1242

Daltry, JC, Wuster, W., & Thorpe, RS (1996). Diet dan evolusi racun ular. Alam, 379(6565), 537-540. doi:10.1038/379537a0

Fitch, AJ, Goodman, AE, & Donnellan, SC (2006). Filogeni molekuler kadal monitor Australia (Squamata: Varanidae) disimpulkan dari urutan DNA mitokondria. Jurnal Zoologi Australia, 54(4), 253-269. doi:10.1071/zo05038

Fry, BG, NR Casewell, W. Wuster, N. Vidal, dan TN Jackson. (2012a). Diversifikasi struktural dan fungsional sistem racun reptil Toxicofera. Racun 60(4) 434-448

Fry, BG, N. Vidal, JA Norman, FJ Vonk, H. Scheib, SFR Ramjan, S. Kuruppu, K. Fung, SB Hedges, MK Richardson, WC Hodgson, V. Ignjatovic, R. Summerhayes dan E. Kochva. (2006). Evolusi awal sistem racun pada kadal dan ular. Alam 439: 584-588.

Fry, BG, Wroe, S., Teeuwisse, W., Van Osch, M., Moreno, K., Ingle, J., . . . Bangun, D. (2009). Peran Utama Racun dalam Predasi oleh Varanus komodoensis (Komodo Dragon) dan Raksasa Varanus (Megalania) priscus yang Punah. Prosiding National Academy of Sciences Amerika Serikat, 106(22), 8969-8974 .

Glenn, JL, & Lurus, RC (1989). Intergradasi populasi racun A dan racun B dari ular berbisa Mojave (Crotalus scutulatus scutulatus) di Arizona. Racun, 27(1), 47-54. doi:10.1016/0041-0101(89)90288-2

Sopiev, O., BM Makeev, SB Kudryavtsev dan AN Makarov. 1987. Kasus keracunan oleh gigitan biawak abu-abu (Varanus griseus). Izvestiva Akademii Nauk Turkmenskoi SSR, Seriya Biologitsheskikh Nauk 87: 78.

Manis, S. (2016). Mengejar Flamingo: Toxicofera dan Kesalahpahaman Venom di Varanid Lizards. Lembaga Penelitian dan Pengembangan, Universitas Suan Sunandha Rajabhat. 123-149.