UNE analyse fonctionnelle des protéines varanid vemon et sale l'écologie.
Ces informations de recherche m'ont été fournies directement par l'auteur Alexandra Matossian au nom du démarrage du site Web du bon pied. Un grand merci à elle et à Matt McDowell @Arboreal Obsurcities ! Découvrez une courte présentation vidéo également par A. Matossian dans la section médias sous Venomus research.
Proposition de subvention NSF
Matossien -
Proposition préliminaire d'IOS : Une analyse fonctionnelle des protéines de venin de varanides et de l'écologie alimentaire.
Cadre conceptuel et objectifs spécifiques
On pensait auparavant que les dragons de Komodo, le plus grand des varans, avaient une bouche infestée de bactéries, provoquant un empoisonnement du sang et la mort de leurs proies. Cependant, les chercheurs ont examiné de manière approfondie Varanus komodoensis et ont découvert des glandes à venin avancées dans la mâchoire inférieure (Fry et al., 2009). Il a également été démontré que d'autres varanides possèdent des glandes à venin; V. acanthurus, V. mitchelli, V. panoptes rubidus et V. varius. Les morsures de V. griseus et de V. scalaris se sont également avérées compatibles avec les symptômes d'envenimation (Sopiev et al., 1987, Ballard & Antonio, 2001). Malgré la présence de glandes à venin, les varanides n'ont pas le système de livraison de dentition spécialisé qui est présent dans d'autres membres du clade de toxicofera proposé, Serpentes et Heloderma (Fry et al., 2006). Les varanides possèdent également plusieurs moyens de prédation et de défense, comme fouetter la queue des attaquants ou utiliser la bouche et les griffes pour maîtriser les proies (Fry et al., 2009).
Il a été montré que l'alimentation joue un rôle majeur dans l'évolution de la variabilité des venins (Barlow et al., 2009). Même les changements ontogénétiques du régime alimentaire peuvent entraîner des changements dans la composition du venin, comme on le voit chez B. jacara , qui se nourrit principalement d'ectothermes à l'état juvénile et d'endothermes à l'âge adulte; cela ne se voit pas chez B. alternatus qui se nourrit presque entièrement d'endothermes tout au long de sa vie (Andrade et Abe, 1999). Le régime alimentaire des varanides varie considérablement : la grande majorité du genre est carnivore, mais il existe plusieurs frugivores (V. olivaceus, V. bitatawa) et d'autres spécialistes comme V. dumerilli, qui mangent principalement des crustacés (Brandenburg, 1983). Par conséquent, il est raisonnable de suggérer la possibilité que la composition du venin de varanide varie également selon le régime alimentaire.
Cette recherche proposée se concentrera principalement sur la fonction écologique du venin de varanide. La fonction principale du venin est-elle d'aider à la prédation ? Je me concentrerai sur l'exploration du protéome du venin de trois espèces de varanides disponibles aux États-Unis : V. acanthurus, V. panoptes horni, la sous-espèce de Nouvelle-Guinée de V. panoptes et V. salvadorii, le parent le plus proche de V. komodoensis. Cela se fera en rassemblant des données de HPLC, de séquençage N-terminal, de spectrométrie de masse et en utilisant l'analyse BLAST pour déterminer les familles de protéines connues présentes dans le venin de varanide. Cette recherche vise également à comprendre le rôle que joue le régime alimentaire dans la détermination des caractéristiques du venin - le venin de varanide varie-t-il selon les espèces en ce qui concerne ses espèces de proies préférées ? L'analyse du régime alimentaire des serpents qui possèdent les mêmes protéines dans leur venin sera comparée au régime alimentaire de chaque espèce de varanide.
Raisonnement
Il a été démontré que les espèces qui développent d'autres moyens de prédation (par exemple, la constriction) ou développent un régime ovophage, subissent une dégénérescence rapide des glandes à venin et du système de distribution du venin en raison du coût énergétique élevé de la production de venin (Fry et al., 2012 ). Compte tenu de la taille des glandes et du rendement en venin de V. komodoensis et V. varius, leur biologie soutient que le venin a une fonction importante ((Barlow et al., 2009). De plus, la complexité des glandes à venin de Komodo a été étudiée ; L'espèce possède des glandes séreuses le long de la mâchoire inférieure, qui ont une lumière centrale et des conduits menant aux bases des dents Cette étude a également documenté la diversité des toxines présentes dans le venin de V. komodoensis, y compris AVIT, CRISP, kallicréine, natriurétique et PLA2, qui principalement provoquer une hypotension, une anticoagulation, une stimulation de l'inflammation et une paralysie des muscles lisses (Fry et al., 2012).
Les lézards moniteurs secouent fréquemment la tête, ravagent la proie avec leurs griffes et la traumatisent autrement afin de maîtriser l'animal; permettre simplement au lézard de mordre une proie ne fournira aucune donnée utile en ce qui concerne l'efficacité du venin. Par exemple, V. komodensis possède de grandes dents dentelées et utilise une stratégie de préhension et de déchirure qui inflige de profondes blessures parallèles aux grandes proies en plus de l'envenimation. Il est important de noter qu'il s'agit d'une composante majeure du comportement de prédation des varans, dans la mesure où le venin ne peut être efficace que lorsque la proie subit déjà un traumatisme physique et une perte de sang compte tenu de ses propriétés anticoagulantes et hypotensives déjà mentionnées (Fry et al. , 2009).
Hypothèses
Question 1 : Pourquoi les varanides possèdent-ils des glandes à venin avancées ? Q1 Hypothèse 1 : La fonction principale du venin de varanide est d'aider à la prédation par le biais de facteurs protéiques d'anticoagulation et d'induction de choc. Cette analyse prédit que le venin possède des facteurs d'anticoagulation qui devraient fonctionnellement augmenter le flux sanguin des proies à travers les blessures infligées par le moniteur, et peuvent également diminuer la pression artérielle. Nous prédisons également que les varanides frugivores possèdent des glandes à venin dégénérées.
Question 2 : Comment et pourquoi le venin de varanide diffère-t-il en composition entre les espèces ? Q2 Hypothèse 1 : Des protéines toxiques spécifiques dans le venin de varanide ont sélectivement évolué pour être plus efficaces sur leur proie préférée. Par conséquent, le venin variera entre les varanides dont le régime alimentaire diffère considérablement. Il s'ensuit également que le venin de varanide peut avoir des effets variables sur différentes espèces, étant le plus efficace sur ce dont il se nourrit le plus souvent. De multiples observations in situ du régime alimentaire des varanides seront analysées et comparées à d'autres compilations de prédation des varans afin d'évaluer les espèces de proies que chaque espèce de varanides favorise le plus. Q2 Hypothèse 2 : La variation géographique et la spéciation ont permis la diversification des protéines de venin. Les populations de Crotalus scutulatus scutulatus produisent différents types de venin en fonction de leur variation géographique, et là où les gammes s'intègrent, un troisième type de venin en résulte (Glenn & Straight, 1989). Cette hypothèse prédit que plus la différence géographique et évolutive est grande, plus il y aura de différences dans la composition et les concentrations de venin. Plus d'espèces de varanides seront nécessaires pour conclure des différences significatives basées sur la géographie, mais pour cette recherche, V. acanthurus est suffisamment éloigné du nord-ouest de l'Australie, loin de V. panoptes horni et V. salvadorii qui se chevauchent dans l'aire de répartition du sud de la Nouvelle-Guinée. Les données sur V. panoptes horni et V. salvadorii seront analysées pour déterminer le degré de parenté par rapport à V. acanthurus.
Conception de la recherche
Extraction de venin
Il n'y a pas de protocole standard pour l'extraction de venin chez les varanides, donc je suivrai les directives pour l'extraction de venin d'Heloderma, avec quelques modifications pour compenser les différences physiologiques des varanides.
Les lézards sont manipulés en toute sécurité avec un risque minimal de blessure pour le gardien et l'animal en saisissant fermement l'animal à la base du cou et des épaules. Cela se fait pour les petits animaux en mettant le cou entre le majeur et l'annulaire tout en enroulant le pouce autour, et pour les plus gros animaux, en enroulant une main autour du cou. Ensuite, l'animal est saisi par la base de la queue et soulevé dans les airs, soutenu par la main sur son cou et sa poitrine, tandis que l'autre main se tient sous les hanches et les pattes arrière. Le lézard est alors attiré près du corps, avec la queue pressée entre le bras et l'abdomen, ou entre les jambes. Si la queue n'est pas attachée, le lézard risque de la blesser en coups de fouet défensifs pour se dégager.
Les lézards sont incités à mordre à plusieurs reprises sur un tube en caoutchouc souple (un mamelon stérilisé utilisé pour traire les veaux a été signalé comme très efficace par le Kentucky Reptile Zoo) vers l'arrière de la bouche, et les glandes à venin sont ensuite doucement massées pour faciliter la libération de venin qui sera ensuite pipeté directement de la bouche. Les varanides n'ont que des glandes à venin dans leur mâchoire inférieure, de sorte que la pipette puisera dans cette région de la bouche. Certains venins peuvent également s'accumuler dans le tube, de sorte que le processus est effectué sur un mécanisme de collecte de venin traditionnel pour les serpents afin de garantir que tout le venin est capturé au cours du processus.
Il a été démontré que le venin de serpent à sonnette n'est en grande partie pas affecté par des conditions de stockage variant jusqu'à 117C. Par conséquent, la température à laquelle le venin est stocké n'est pas quelque chose qui nous préoccupe beaucoup, et nous stockons donc le venin à température ambiante.
Élevage en captivité
Le venin nécessite de l'énergie pour être fabriqué, de sorte que les varanides qui sont traites pour leur venin doivent être bien nourris pour s'assurer qu'il n'y a pas de baisse de l'état corporel en raison du stress ou d'un métabolisme accru dû à la production de venin. Chaque individu est extrait au maximum tous les 14 jours. Ils sont nourris de manière variée régime de proies entières congelées-décongelées qui imite ce dont elles se nourrissent dans la nature, avec de la nourriture offerte après l'extraction, et sinon tous les deux jours.
Les lézards seront maintenus dans des enclos dont les températures, le mobilier, l'humidité, les précipitations et les cycles de lumière (y compris les UVA/UVB) imitent leur environnement naturel. Chaque espèce verra ses besoins spécialement satisfaits en fonction des variations géographiques et des exigences, et maintenus constants pour tous les individus de la même espèce. Les individus sont logés dans des enclos séparés qui mesurent au moins une longueur de corps en largeur et deux longueurs de corps en hauteur et en longueur. Les espèces terrestres ont fourni un minimum de 18 pouces de terre pour permettre un bon cycle des femelles et pour aider au maintien de l'humidité, ainsi que pour enrichir et soutenir les comportements naturels. L'eau douce est disponible à tout moment. Chaque animal reçoit une baignoire suffisamment grande pour s'y immerger complètement, et celle-ci est changée quotidiennement. Tous les animaux sont sexuellement matures. Les manipulations seront réduites au minimum afin de réduire le stress de l'animal, mais l'entretien de la cage sera effectué quotidiennement.
Essai
Pour tester l'hypothèse selon laquelle le venin aide à neutraliser les proies, le venin sera prélevé sur trois espèces de varanides. V. acanthurus, V. panoptes horni et V. salvadorii ont été sélectionnés en raison de leur disponibilité aux États-Unis, en particulier en tant que spécimens élevés en captivité, et en raison de la variation distincte entre les espèces bien qu'elles soient toutes des varans indo-australiens (Fitch et al , 2006). V. acanthurus est une espèce de moniteur terrestre nain d'Australie qui se nourrit principalement d'insectes; V. panoptes horni est un moniteur terrestre de taille moyenne de Nouvelle-Guinée et un prédateur généraliste des vertébrés et des invertébrés à parts égales; V. salvadorii est un grand lézard arboricole également de Nouvelle-Guinée qui se nourrit presque exclusivement d'oiseaux, d'œufs et de mammifères (Arbuckle, 2009).
Des analyses toxicologiques seront effectuées sur du venin brut prélevé sur ces espèces. Les toxines seront isolées pour déterminer celles qui sont partagées entre les espèces de varanides et les autres reptiles venimeux. Lors de l'extraction, des mesures seront prises en ce qui concerne la quantité de venin, le poids corporel et la SVL (longueur du museau à l'évent). Une analyse comparative par l'utilisation de tests ANOVA sera effectuée. Il s'agit de déterminer s'il existe une différence de venin au sein d'une espèce, en particulier en fonction de la taille, car les varans se nourrissent de différents objets tout au long de leur vie. Cependant, tous les varans utilisés dans cette étude sont des adultes sexuellement matures.
Des tests de protéome de venin seront effectués avec ces trois espèces connues pour posséder des glandes à venin, en collectant du venin et en effectuant une analyse venimonique. Cela commencera par une analyse de venin brut à l'aide de la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inverse. Chaque fraction protéique sera caractérisée par séquençage N-terminal et détermination par spectrométrie de masse des masses moléculaires et de la teneur en cystéine. Les protéines avec une seule séquence N-terminale, une seule masse moléculaire et une seule bande électrophorétique seront caractérisées à l'aide d'une analyse BLAST. À partir de l'analyse BLAST, une famille de protéines connue devrait être discernable, à moins que les varanides ne possèdent de nouvelles toxines, ce qui dépasse le cadre de cette recherche prévue. Cette approche a permis le séquençage et l'analyse avancés du venin de serpent (Bazaa et al., 2005, Calvete et al., 2007). Des ANOVA seront effectuées pour déterminer s'il existe une variation significative entre les toxines présentes dans chacune des trois espèces.
Une analyse plus approfondie sera effectuée pour isoler la proie la plus affectée par le venin de chaque espèce et voir si cela correspond aux observations du régime alimentaire naturel de cette espèce. Cela sera extrapolé en comparant les protéines de venin de serpent connues et leurs effets sur diverses espèces aux protéines trouvées via l'analyse BLAST dans le venin de varanide.
Globalement, je cherche à analyser et séquencer les protéines présentes dans le venin de varanide. Je tenterai également d'analyser les liens possibles entre les toxines spécifiques à l'espèce, leur abondance relative et les espèces de proies préférées des varanides.
Impacts plus larges des travaux proposés
S'il n'y a pas d'effet significatif du venin de varanide sur l'un de ses types de proies, des tests supplémentaires sont nécessaires pour déterminer quelle est la fonction écologique du venin chez les varans, sinon pour aider à la prédation. Certains chercheurs ont fait valoir qu'en raison de la nature physique agressive de la prédation des varanides, il n'y a peut-être aucun objectif écologique pour les varanides possédant du venin (Sweet, 2016). Ceci est encore significatif, car nous pourrons alors observer la dégénérescence de glandes à venin énergétiquement coûteuses. Le tester pour ses propriétés antimicrobiennes / antiparasitaires, ainsi que pour toutes les enzymes et propriétés digestives, est une recherche supplémentaire qui doit être effectuée quels que soient les résultats de cette étude. Chez les vipérides, les élapidés et les colubrides, le venin a de multiples fonctions, il est donc probable que le venin remplisse également de multiples fonctions pour Varanus.
S'il y a un effet significatif du venin de varanide sur l'un de ses types de proies, il est significatif de plusieurs manières. Premièrement, cela apporte un soutien supplémentaire au clade proposé de Toxicofera, qui suggère que tous les reptiles descendent d'un ancêtre squamate commun producteur de venin. La phylogénétique des reptiles évolue constamment, donc cette recherche fournit des preuves supplémentaires pour soutenir ou réfuter la théorie. Deuxièmement, cela montre que les sécrétions orales biochimiques des squamates nécessitent une étude plus approfondie, car ce n'est que récemment qu'il a été proposé que les membres des Varanidae possèdent du venin par opposition à de simples bouches infestées de bactéries. Troisièmement, cela a des implications sur le commerce des animaux de compagnie, car tous les États ont des réglementations sur la détention privée de serpents venimeux, mais les varanides sont moins réglementés et plus couramment gardés. Enfin, cette recherche peut aider à ouvrir les possibilités d'utilisation du venin de varanide comme technologie médicale. Le captopril et le tirofiban sont respectivement des inhibiteurs de l'ECA et des médicaments antiplaquettaires, qui ont été isolés du venin de Bothrops jararaca et d'Echis carinatus. Je crois que le venin de varanide peut également posséder des toxines qui peuvent être utilisées pour créer des médicaments thérapeutiques et des produits pharmaceutiques qui améliorent la vie humaine.
Liste de référence
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