A análisis funcional de proteínas varanid vemon y sucio ecología
La información de esta investigación me ha sido proporcionada directamente por la autora Alexandra Matossian en nombre de iniciar el sitio web correctamente. ¡Muchas gracias a ella y a Matt McDowell @Arboreal Obsurcities! Echa un vistazo a una breve presentación en video también de A. Matossian en la sección de medios bajo la investigación de Venomus.
Propuesta de subvención NSF
Matossiano -
Propuesta preliminar de IOS: un análisis funcional de las proteínas del veneno varanid y la ecología dietética.
Marco Conceptual y Objetivos Específicos
Anteriormente se pensaba que los dragones de Komodo, los lagartos monitores más grandes, poseían bocas infestadas de bacterias, lo que causaba envenenamiento de la sangre y mortalidad en sus presas. Sin embargo, los investigadores han examinado ampliamente a Varanus komodoensis y han descubierto glándulas venenosas avanzadas en la mandíbula inferior (Fry et al., 2009). También se ha demostrado que otras varánidas poseen glándulas venenosas; V. acanthurus, V. mitchelli, V. panoptes rubidus y V. varius. También se ha demostrado que las mordeduras de V. griseus y V. scalaris son consistentes con síntomas de envenenamiento (Sopiev et al., 1987, Ballard & Antonio, 2001). A pesar de la presencia de glándulas venenosas, las varanidas carecen del sistema de entrega de dentición especializado que está presente en otros miembros del clado propuesto de toxicofera, Serpentes y Heloderma (Fry et al., 2006). Varanids también posee varios medios de depredación y defensa, como azotar la cola a los atacantes o usar la boca y las garras para someter a la presa (Fry et al., 2009).
Se ha demostrado que la dieta juega un papel importante en la evolución de la variabilidad del veneno (Barlow et al., 2009). Incluso los cambios ontogenéticos en la dieta pueden causar cambios en la composición del veneno, como se ve en B. jacara, que se alimenta principalmente de ectotermos cuando es joven y endotermos cuando es adulto; esto no se ve en B. alternatus, que se alimenta casi por completo de endotermos a lo largo de su vida (Andrade y Abe, 1999). Varanids varía mucho en la dieta: la gran mayoría del género es carnívoro, pero hay varios frugívoros (V. olivaceus, V. bitatawa) y otros especialistas como V. dumerilli, que se alimentan predominantemente de crustáceos (Brandenburg, 1983). Por lo tanto, es razonable sugerir la posibilidad de que la composición del veneno varanid también varíe según la dieta.
Esta investigación propuesta se centrará principalmente en la función ecológica del veneno varanid. ¿La función principal del veneno es ayudar en la depredación? Me centraré en explorar el proteoma del veneno de tres especies de varanid disponibles en los Estados Unidos: V. acanthurus, V. panoptes horni, la subespecie de Nueva Guinea de V. panoptes y V. salvadorii, el pariente más cercano de V. komodoensis. Esto se hará mediante la recopilación de datos de HPLC, secuenciación N-terminal, espectrometría de masas y mediante el uso de análisis BLAST para determinar las familias de proteínas conocidas presentes en el veneno de varanid. Esta investigación también busca comprender el papel que juega la dieta en la determinación de las características del veneno: ¿el veneno varanid varía según la especie con respecto a su especie de presa favorita? El análisis de la dieta de las serpientes que poseen las mismas proteínas en su veneno se comparará con la dieta de cada especie varánida.
Razón fundamental
Se ha demostrado que las especies que desarrollan otros medios de depredación (p. ej., constricción) o desarrollan una dieta ovofaga, sufren una rápida degeneración de las glándulas venenosas y del sistema de administración del veneno debido al alto costo energético de la producción del veneno (Fry et al., 2012). ). Dado el tamaño de las glándulas y la producción de veneno de V. komodoensis y V. varius, su biología argumenta que el veneno tiene una función importante ((Barlow et al., 2009). Además, se ha estudiado la complejidad de las glándulas venenosas de Komodo; la especie posee glándulas serosas a lo largo de la mandíbula inferior, que tienen luces centrales y conductos que conducen a las bases de los dientes.Este estudio también documentó la diversidad de toxinas presentes en el veneno de V. komodoensis, incluidas AVIT, CRISP, calicreína, natriurético y PLA2, que principalmente causar hipotensión, anticoagulación, estimulación de la inflamación y parálisis del músculo liso (Fry et al., 2012).
Los lagartos monitores con frecuencia sacuden la cabeza, destrozan la presa con sus garras y la traumatizan de otra manera para someter al animal; simplemente permitir que la lagartija muerda una presa no proporcionará datos útiles con respecto a la eficacia del veneno. Por ejemplo, V. komodensis posee dientes grandes y aserrados y emplea una estrategia de agarre y desgarro que inflige heridas paralelas profundas en presas grandes, además del envenenamiento. Es importante tener en cuenta que este es un componente importante del comportamiento de depredación del lagarto monitor, en la medida en que el veneno solo puede ser efectivo cuando la presa ya está experimentando un trauma físico y pérdida de sangre debido a sus propiedades anticoagulantes e hipotensoras ya mencionadas (Fry et al. , 2009).
Hipótesis
Pregunta 1: ¿Por qué los varánidos poseen glándulas venenosas avanzadas? Q1 Hipótesis 1: La función principal del veneno varanid es ayudar en la depredación a través de factores proteicos de anticoagulación e inducción de shock. Este análisis predice que el veneno posee factores de anticoagulación que deberían aumentar funcionalmente el flujo sanguíneo de la presa a través de las lesiones infligidas por el monitor y también puede disminuir la presión arterial. También predecimos que los varánidos frugívoros poseen glándulas venenosas degeneradas.
Pregunta 2: ¿Cómo y por qué el veneno varanid difiere en composición entre especies? P2 Hipótesis 1: Proteínas tóxicas específicas en el veneno de las varanidas han evolucionado selectivamente para ser más efectivas en sus presas favoritas. Por lo tanto, el veneno variará entre los varánidos que difieren significativamente en la dieta. También se deduce que el veneno varanid puede tener efectos variables en diferentes especies, siendo más efectivo en lo que comúnmente se alimenta. Se analizarán múltiples observaciones in situ de la dieta de los varanidos y se compararán con otras compilaciones de depredación de lagartos monitores para evaluar qué especies de presa favorece más cada especie de varanidos. Q2 Hipótesis 2: La variación geográfica y la especiación han permitido la diversificación de las proteínas del veneno. Las poblaciones de Crotalus scutulatus scutulatus producen diferentes tipos de veneno en función de su variación geográfica, y donde se integran los rangos, resulta un tercer tipo de veneno (Glenn & Straight, 1989). Esta hipótesis predice que cuanto mayor sea la diferencia geográfica y evolutiva, se producirán más diferencias en la composición y concentración del veneno. Se necesitarán más especies de varánidos para concluir diferencias significativas basadas en la geografía, pero para esta investigación, V. acanthurus está lo suficientemente lejos del noroeste de Australia, lejos de V. panoptes horni y V. salvadorii, que se superponen en rango en el sur de Nueva Guinea. Los datos de V. panoptes horni y V. salvadorii se analizarán para determinar el grado de relación en comparación con V. acanthurus.
Diseño de la investigación
Extracción de veneno
No existe un protocolo estándar para la extracción de veneno en varanids, por lo que seguiré las pautas para la extracción de veneno de Heloderma, con algunas modificaciones para compensar las diferencias fisiológicas de varanids.
Las lagartijas se manipulan de forma segura con un riesgo mínimo de lesiones para el cuidador y el animal sujetando firmemente al animal por la base del cuello y los hombros. Esto se hace para animales más pequeños colocando el cuello entre el dedo medio y el anular mientras se envuelve el pulgar, y para animales más grandes, envolviendo una mano alrededor del cuello. Luego, el animal es agarrado por la base de la cola y levantado en el aire, sostenido por la mano en el cuello y el pecho, mientras que la otra mano lo sujeta por debajo de las caderas y las patas traseras. Luego se acerca la lagartija al cuerpo, con la cola presionada entre el brazo y el abdomen, o entre las piernas. Si la cola no está asegurada, la lagartija corre el riesgo de herirla con látigos defensivos para liberarse.
Se atrae a las lagartijas para que muerdan repetidamente un tubo de goma blanda (el Zoológico de Reptiles de Kentucky ha informado que una tetina esterilizada utilizada para ordeñar terneros es muy eficaz) hacia la parte posterior de la boca, y luego se masajean suavemente las glándulas venenosas para facilitar la extracción. liberación de veneno que posteriormente será pipeteado directamente de la boca. Los varánidos solo tienen glándulas venenosas en la mandíbula inferior, por lo que la pipeta se extraerá de esa región de la boca. También se puede acumular algo de veneno en el tubo, por lo que el proceso se realiza sobre un mecanismo tradicional de recolección de veneno para serpientes para garantizar que todo el veneno se capture en el proceso.
Se ha demostrado que el veneno de serpiente de cascabel no se ve afectado en gran medida por las condiciones de almacenamiento que varían hasta 117C. Por lo tanto, la temperatura a la que se almacena el veneno no es algo que nos preocupe mucho y, por lo tanto, estamos almacenando el veneno a temperatura ambiente.
Cría en cautiverio
El veneno requiere energía para ser producido, por lo que las varanidas que son ordeñadas por su veneno deben ser bien alimentadas para asegurar que no haya una disminución en la condición corporal como resultado del estrés o el aumento del metabolismo por la producción de veneno. Cada individuo se extrae como máximo cada 14 días. Se alimentan de una variada dieta de presas enteras congeladas y descongeladas que imita lo que cazarían en la naturaleza, con alimentos ofrecidos después de la extracción y, de lo contrario, cada dos días.
Las lagartijas se mantendrán en recintos que tengan temperaturas, mobiliario, humedad, precipitación y ciclos de luz (incluidos los rayos UVA/UVB) que imiten su entorno natural. Cada especie tendrá sus necesidades especialmente satisfechas en función de la variación geográfica y los requisitos, y se mantendrán constantes entre todos los individuos de la misma especie. Los individuos se alojan en recintos separados que miden como mínimo una longitud corporal de ancho y dos longitudes corporales de alto y largo. Las especies terrestres proporcionaron un mínimo de 18” de tierra para permitir el ciclo adecuado de las hembras y para ayudar a mantener la humedad, así como para enriquecer y apoyar los comportamientos naturales. El agua dulce está disponible en todo momento. A cada animal se le da una tina lo suficientemente grande como para sumergirse completamente, y se cambia diariamente. Todos los animales son sexualmente maduros. El manejo se mantendrá al mínimo para reducir el estrés del animal, pero el mantenimiento de la jaula se realizará a diario.
Pruebas
Para probar la hipótesis de que el veneno ayuda a incapacitar a las presas, se recolectará veneno de tres especies de varánidos. Se seleccionaron V. acanthurus, V. panoptes horni y V. salvadorii debido a su disponibilidad en los Estados Unidos, especialmente como especímenes criados en cautiverio, y debido a la clara variación entre especies a pesar de que todos son lagartos monitores indoaustralianos (Fitch et al. , 2006). V. acanthurus es una especie de monitor terrestre enano de Australia que se alimenta principalmente de insectos; V. panoptes horni es un monitor terrestre de tamaño mediano de Nueva Guinea y un depredador generalista tanto en vertebrados como en invertebrados por igual; V. salvadorii es un gran lagarto arbóreo también de Nueva Guinea que se alimenta casi exclusivamente de aves, huevos y mamíferos (Arbuckle, 2009).
El análisis toxicológico se realizará en el veneno crudo recolectado de estas especies. Las toxinas se aislarán para determinar cuáles se comparten entre las especies de varánidos y otros reptiles venenosos. Tras la extracción, se tomarán medidas con respecto a la cantidad de veneno, el peso corporal y SVL (longitud del hocico al respiradero). Se realizará un análisis comparativo mediante el uso de pruebas ANOVA. Esto es para determinar si hay alguna diferencia en el veneno dentro de una especie, particularmente en función del tamaño, ya que los lagartos monitores se alimentan de diferentes elementos a lo largo de su vida. Sin embargo, todos los lagartos monitores utilizados en este estudio son adultos sexualmente maduros.
Las pruebas del proteoma del veneno se realizarán con estas tres especies que se sabe que poseen glándulas venenosas, recolectando veneno y realizando un análisis venomónico. Esto comenzará con el análisis de veneno crudo utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de fase inversa. Cada fracción de proteína se caracterizará por secuenciación N-terminal y determinación espectrométrica de masas de masas moleculares y contenido de cisteína. Las proteínas con una sola secuencia N-terminal, masa molecular y una sola banda electroforética se caracterizarán mediante análisis BLAST. A partir del análisis BLAST, debería ser discernible una familia de proteínas conocida, a menos que las varanidas posean toxinas nuevas, lo que está más allá del alcance de esta investigación prevista. Este enfoque ha permitido la secuenciación y el análisis avanzados del veneno de serpiente (Bazaa et al., 2005, Calvete et al., 2007). Se realizarán ANOVA para determinar si existe una variación significativa entre las toxinas presentes en cada una de las tres especies.
Se realizarán más análisis para aislar la presa más afectada por el veneno de cada especie y ver si coincide con las observaciones de la dieta natural de esa especie. Esto se extrapolará mediante la comparación de las proteínas conocidas del veneno de serpiente y sus efectos en varias especies con las proteínas encontradas a través del análisis BLAST en el veneno de varanid.
En general, busco analizar y secuenciar las proteínas presentes en el veneno de las varanidas. También intentaré analizar las posibles conexiones entre las toxinas específicas de la especie, su abundancia relativa y las especies de presa favoritas de los varánidos.
Impactos más amplios del trabajo propuesto
Si no hay un efecto significativo del veneno varanid en ninguno de sus tipos de presa, entonces se necesitan más pruebas para determinar cuál es la función ecológica del veneno en los lagartos monitores, si no es para ayudar en la depredación. Algunos investigadores han argumentado que debido a la naturaleza física agresiva de la depredación varanid, posiblemente no haya un propósito ecológico para que los varanid posean veneno (Sweet, 2016). Esto sigue siendo significativo, ya que entonces podremos observar la degeneración de las glándulas venenosas energéticamente caras. Probar sus propiedades antimicrobianas/antiparasitarias, así como las enzimas y propiedades digestivas, es una investigación adicional que debe realizarse independientemente de los resultados de este estudio. En vipéridos, elápidos y colúbridos, el veneno tiene múltiples funciones, por lo que es probable que el veneno también cumpla múltiples funciones para Varanus.
Si hay un efecto significativo del veneno varanid en cualquiera de sus tipos de presa, es significativo de múltiples maneras. En primer lugar, presta apoyo adicional al clado Toxicofera propuesto, que sugiere que todos los reptiles descienden de un ancestro escamoso productor de veneno común. La filogenética de los reptiles está en constante evolución, por lo que esta investigación proporciona más evidencia para apoyar o refutar la teoría. En segundo lugar, muestra que las secreciones orales bioquímicas de los escamosos requieren más estudio, ya que solo recientemente se ha propuesto que los miembros de Varanidae poseen veneno en lugar de solo bocas infestadas de bacterias. En tercer lugar, tiene implicaciones en el comercio de mascotas, ya que todos los estados tienen regulaciones sobre la tenencia privada de serpientes venenosas, pero las varanidas están menos reguladas y son más comunes. Finalmente, esta investigación puede ayudar a abrir las posibilidades de utilizar el veneno varanid como tecnología médica. Captopril y Tirofiban son inhibidores de la ECA y antiplaquetarios, respectivamente, que fueron aislados del veneno de Bothrops jararaca y Echis carinatus. Creo que el veneno de varanid también puede poseer toxinas que pueden utilizarse para crear medicamentos terapéuticos y productos farmacéuticos que mejoren la vida humana.
Lista de referencia
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