EIN  funktionelle Analyse von Varanid-Vemon-Proteinen und  dreckig  Ökologie . 

Diese Forschungsinformationen wurden mir direkt von der Autorin Alexandra Matossian zur Verfügung gestellt, um die Website richtig zu starten. Ein großes Dankeschön an sie und Matt McDowell @Arboreal Obsurcities ! Sehen Sie sich auch eine kurze Videopräsentation von A. Matossian im Medienbereich unter Venomus-Forschung an.

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NSF-Zuschussantrag

Matossian -

IOS Preliminary Proposal: Eine funktionelle Analyse von Varanidengiftproteinen und Ernährungsökologie.

Konzeptioneller Rahmen und spezifische Ziele

Komodo-Drachen, die größten Warane, wurden früher für bakterienverseuchte Mäuler gehalten, die bei ihrer Beute zu Blutvergiftungen und Todesfällen führten. Forscher haben jedoch Varanus komodoensis ausgiebig untersucht und fortgeschrittene Giftdrüsen im Unterkiefer entdeckt (Fry et al., 2009). Es wurde auch gezeigt, dass andere Varaniden Giftdrüsen besitzen; V. acanthurus, V. mitchelli, V. panoptes rubidus und V. varius. Es wurde auch gezeigt, dass V. griseus- und V. scalaris-Bisse mit Vergiftungssymptomen übereinstimmen (Sopiev et al., 1987, Ballard & Antonio, 2001). Trotz des Vorhandenseins von Giftdrüsen fehlt Varaniden das spezialisierte Gebisssystem, das in anderen Mitgliedern der vorgeschlagenen Toxikofera-Klade, Serpentes und Heloderma, vorhanden ist (Fry et al., 2006). Varaniden besitzen auch mehrere Mittel zur Jagd und Verteidigung, wie z. B. das Peitschen des Schwanzes auf Angreifer oder das Verwenden des Mundes und der Klauen, um Beute zu unterwerfen (Fry et al., 2009).

Es wurde gezeigt, dass die Ernährung eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Giftvariabilität spielt (Barlow et al., 2009). Sogar ontogenetische Veränderungen in der Ernährung können zu Veränderungen der Giftzusammensetzung führen, wie bei B. jacara zu sehen ist, das sich als Jugendlicher hauptsächlich von Ektothermen und als Erwachsener von Endothermen ernährt. dies ist bei B. alternatus nicht zu beobachten, der während seines gesamten Lebens fast ausschließlich Endothermen nachjagt (Andrade und Abe, 1999). Varaniden unterscheiden sich stark in ihrer Ernährung: Die überwiegende Mehrheit der Gattung ist Fleischfresser, aber es gibt mehrere Frugivoren (V. olivaceus, V. bitatawa) und andere Spezialisten wie V. dumerilli, die hauptsächlich Krebstiere fressen (Brandenburg, 1983). Daher ist es vernünftig anzunehmen, dass die Zusammensetzung des Varanidengifts auch je nach Ernährung variieren kann.

Diese vorgeschlagene Forschung wird sich hauptsächlich auf die ökologische Funktion des Varanidengiftes konzentrieren. Ist die primäre Funktion des Giftes die Unterstützung bei Raubtieren? Ich werde mich auf die Erforschung des Giftproteoms von drei Arten von Varaniden konzentrieren, die in den Vereinigten Staaten erhältlich sind: V. acanthurus, V. panoptes horni, die Neuguinea-Unterart von V. panoptes, und V. salvadorii, der nächste Verwandte von V. komodoensis. Dies wird durch das Sammeln von Daten aus HPLC, N-terminaler Sequenzierung, Massenspektrometrie und durch Verwendung der BLAST-Analyse zur Bestimmung bekannter Proteinfamilien, die im Varanidengift vorhanden sind, durchgeführt. Diese Forschung versucht auch zu verstehen, welche Rolle die Ernährung bei der Bestimmung der Gifteigenschaften spielt – variiert das Varanidengift je nach Art in Bezug auf seine bevorzugte Beuteart? Die Analyse der Ernährung von Schlangen, die die gleichen Proteine in ihrem Gift enthalten, wird mit der Ernährung jeder Varanidenart verglichen.

Begründung

Es wurde gezeigt, dass Arten, die andere Raubmittel entwickeln (z. B. Verengung) oder eine ovophage Ernährung entwickeln, aufgrund der hohen Energiekosten der Giftproduktion eine schnelle Degeneration der Giftdrüsen und des Giftabgabesystems erfahren (Fry et al., 2012 ). Angesichts der Größe der Drüsen und der Giftausbeute von V. komodoensis und V. varius argumentiert ihre Biologie, dass das Gift eine wichtige Funktion hat ((Barlow et al., 2009). Darüber hinaus wurde die Komplexität der Komodo-Giftdrüsen untersucht; die Art besitzt seröse Drüsen entlang des Unterkiefers, die zentrale Lumina und Kanäle aufweisen, die zu den Zahnbasen führen.Diese Studie dokumentierte auch die Vielfalt der im Gift von V. komodoensis vorhandenen Toxine, einschließlich AVIT, CRISP, Kallikrein, Natriuretikum und PLA2, die hauptsächlich Hypotonie, Antikoagulation, Entzündungsstimulation und Lähmung der glatten Muskulatur verursachen (Fry et al., 2012).

Warane schütteln häufig den Kopf, verwüsten das Beutetier mit ihren Krallen und traumatisieren es auf andere Weise, um das Tier zu unterwerfen; es der Eidechse einfach zu erlauben, einen Beutegegenstand zu beißen, wird keine nützlichen Daten in Bezug auf die Wirksamkeit des Giftes liefern.  Zum Beispiel besitzt V. komodensis große, gezackte Zähne und wendet eine Griff- und Reißstrategie an, die großen Beutetieren zusätzlich zur Vergiftung tiefe parallele Wunden zufügt. Es ist wichtig zu beachten, dass dies eine Hauptkomponente des Raubtierverhaltens von Waranen ist, in dem Maße, in dem das Gift aufgrund seiner bereits erwähnten gerinnungshemmenden und blutdrucksenkenden Eigenschaften möglicherweise nur dann wirksam ist, wenn die Beute bereits ein körperliches Trauma und Blutverlust erleidet (Fry et al. , 2009).

Hypothesen

Frage 1: Warum besitzen Varaniden fortgeschrittene Giftdrüsen? Q1 Hypothese 1: Die primäre Funktion des Varanidengiftes besteht darin, die Prädation durch gerinnungshemmende Proteinfaktoren und Schockauslösung zu unterstützen. Diese Analyse sagt voraus, dass Gift Antikoagulationsfaktoren besitzt, die den Blutfluss der Beute durch vom Monitor verursachte Verletzungen funktionell erhöhen und auch den Blutdruck senken können. Wir sagen auch voraus, dass frugivore Varaniden degenerierte Giftdrüsen besitzen.

Frage 2: Wie und warum unterscheidet sich das Varanidengift in der Zusammensetzung zwischen den Arten? Q2 Hypothese 1: Spezifische toxische Proteine im Varanidengift haben sich selektiv entwickelt, um bei ihrer bevorzugten Beute am wirksamsten zu sein. Daher variiert das Gift zwischen Varaniden, die sich in der Ernährung erheblich unterscheiden. Daraus folgt auch, dass Varanidengift unterschiedliche Auswirkungen auf verschiedene Arten haben kann, wobei es am effektivsten ist, was es am häufigsten jagt. Mehrere In-situ-Beobachtungen der Varaniden-Ernährung werden analysiert und mit anderen Zusammenstellungen von Monitoreidechsen-Raubtieren verglichen, um zu beurteilen, welche Beutearten jede Varaniden-Art am meisten bevorzugt. Q2 Hypothese 2: Geografische Variation und Speziation haben die Diversifizierung von Giftproteinen ermöglicht. Crotalus scutulatus scutulatus-Populationen produzieren verschiedene Arten von Gift, basierend auf ihrer geografischen Variation, und wo die Verbreitungsgebiete integriert werden, ergibt sich eine dritte Art von Gift (Glenn & Straight, 1989). Diese Hypothese sagt voraus, dass je größer der geografische und evolutionäre Unterschied ist, desto mehr Unterschiede in der Giftzusammensetzung und -konzentration auftreten werden. Weitere Varanidenarten werden benötigt, um signifikante Unterschiede basierend auf der Geographie zu schließen, aber für diese Forschung ist V. acanthurus ausreichend weit genug entfernt, da es von Nordwestaustralien entfernt ist, weg von V. panoptes horni und V. salvadorii, die sich in ihrem Verbreitungsgebiet in Süd-Neuguinea überschneiden. Die Daten von V. panoptes horni und V. salvadorii werden auf den Verwandtschaftsgrad im Vergleich zu V. acanthurus analysiert.

Forschungsdesign

Giftextraktion

Es gibt kein Standardprotokoll für die Giftextraktion bei Varaniden, daher werde ich die Richtlinien für die Heloderma-Giftextraktion befolgen, mit einigen Modifikationen, um die physiologischen Unterschiede der Varaniden auszugleichen.

Eidechsen werden sicher mit minimalem Verletzungsrisiko für Tierpfleger und Tier gehandhabt, indem das Tier fest am Halsansatz und an den Schultern gefasst wird. Dies geschieht bei kleineren Tieren, indem der Hals zwischen Mittel- und Ringfinger gelegt wird, während der Daumen umwickelt wird, und bei größeren Tieren, indem eine Hand um den Hals gelegt wird. Dann wird das Tier am Schwanzansatz gefasst und in die Luft gehoben, mit der Hand an Hals und Brust gestützt, während die andere Hand unter den Hüften und Hinterbeinen hält. Die Eidechse wird dann eng an den Körper gezogen, wobei der Schwanz zwischen Arm und Bauch oder zwischen die Beine gedrückt wird. Wenn der Schwanz nicht gesichert ist, riskiert die Eidechse, ihn bei defensiven Peitschenhieben zu verletzen, um sich zu befreien.

Die Eidechsen werden dazu verleitet, wiederholt auf einen weichen Gummischlauch (ein sterilisierter Nippel, der zum Melken von Kälbern verwendet wird, wurde vom Kentucky Reptile Zoo als sehr effektiv berichtet) in Richtung des hinteren Mundes zu beißen, und die Giftdrüsen werden dann sanft massiert, um das zu erleichtern Freisetzung von Gift, das anschließend direkt aus dem Mund pipettiert wird. Varaniden haben nur Giftdrüsen in ihrem Unterkiefer, sodass die Pipette aus dieser Mundregion saugt. Etwas Gift kann sich auch in der Röhre ansammeln, daher wird der Prozess über einen traditionellen Giftsammelmechanismus für Schlangen durchgeführt, um sicherzustellen, dass das gesamte Gift dabei aufgefangen wird.

Es hat sich gezeigt, dass Klapperschlangengift von Lagerbedingungen, die bis zu 117 ° C variieren, weitgehend unbeeinflusst bleibt. Daher ist die Temperatur, bei der das Gift gelagert wird, für uns nicht sehr wichtig, und daher lagern wir das Gift bei Raumtemperatur.

Gefangenschaft

Die Herstellung von Gift erfordert Energie, daher müssen Varaniden, die für ihr Gift gemolken werden, gut gefüttert werden, um sicherzustellen, dass die Körperkondition nicht durch Stress oder erhöhten Stoffwechsel durch die Giftproduktion beeinträchtigt wird. Jedem Individuum wird maximal alle 14 Tage entnommen. Sie werden abwechslungsreich ernährt  gefrorene und aufgetaute Vollwertkost, die das nachahmt, was sie in der Natur jagen würden, mit Nahrung, die nach der Extraktion und ansonsten jeden zweiten Tag angeboten wird.

Eidechsen werden in Gehegen gehalten, deren Temperaturen, Einrichtung, Feuchtigkeit, Niederschlag und Lichtzyklen (einschließlich UVA/UVB) ihrer natürlichen Umgebung nachempfunden sind. Die Bedürfnisse jeder Art werden speziell auf der Grundlage geografischer Unterschiede und Anforderungen erfüllt und über alle Individuen derselben Art hinweg konstant gehalten. Einzelpersonen werden in separaten Gehegen untergebracht, die mindestens eine Körperlänge breit und zwei Körperlängen groß und lang sind. Terrestrische Arten stellten mindestens 18 Zoll Erde zur Verfügung, um den Weibchen ein ordnungsgemäßes Radfahren zu ermöglichen und die Aufrechterhaltung der Feuchtigkeit zu unterstützen sowie das natürliche Verhalten zu bereichern und zu unterstützen. Frisches Wasser ist jederzeit verfügbar. Jedes Tier erhält eine Wanne, die groß genug ist, um vollständig darin einzutauchen, und diese wird täglich gewechselt. Alle Tiere sind geschlechtsreif. Die Handhabung wird auf ein Minimum beschränkt, um Stress für das Tier zu reduzieren, aber die Käfigwartung wird täglich durchgeführt.

Testen

     Um die Hypothese zu testen, dass Gift dabei hilft, Beute außer Gefecht zu setzen, wird Gift von drei Arten von Varaniden gesammelt. V. acanthurus, V. panoptes horni und V. salvadorii wurden aufgrund der Verfügbarkeit in den Vereinigten Staaten ausgewählt, insbesondere als in Gefangenschaft gezüchtete Exemplare, und aufgrund der deutlichen Unterschiede zwischen den Arten, obwohl es sich bei allen um indoaustralische Warane handelt (Fitch et al , 2006). V. acanthurus ist eine zwergartige, terrestrische Monitorart aus Australien, die hauptsächlich Insekten frisst; V. panoptes horni ist ein mittelgroßer terrestrischer Waran aus Neuguinea und ein generalistisches Raubtier für Wirbeltiere und Wirbellose gleichermaßen; V. salvadorii ist eine große Baumechse, ebenfalls aus Neuguinea, die sich fast ausschließlich von Vögeln, Eiern und Säugetieren ernährt (Arbuckle, 2009).

An rohem Gift, das von diesen Arten gesammelt wurde, wird eine toxikologische Analyse durchgeführt. Toxine werden isoliert, um festzustellen, welche von Varanidenarten und anderen giftigen Reptilien geteilt werden. Bei der Extraktion werden die Giftmenge, das Körpergewicht und die KRL (Länge von der Schnauze bis zur Kehle) gemessen. Es wird eine vergleichende Analyse durch die Verwendung von ANOVA-Tests durchgeführt. Damit soll festgestellt werden, ob es innerhalb einer Art einen Unterschied im Gift gibt, insbesondere basierend auf der Größe, da Warane während ihrer gesamten Lebensdauer verschiedene Gegenstände erbeuten. Alle in dieser Studie verwendeten Monitoreidechsen sind jedoch geschlechtsreife Erwachsene.

     Mit diesen drei Arten, von denen bekannt ist, dass sie Giftdrüsen besitzen, werden Giftproteomtests durchgeführt, indem Gift gesammelt und eine Giftanalyse durchgeführt wird. Dies beginnt mit der Rohgiftanalyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Jede Proteinfraktion wird durch N-terminale Sequenzierung und massenspektrometrische Bestimmung der Molekülmasse und des Cysteingehalts charakterisiert. Proteine mit einer einzigen N-terminalen Sequenz, Molekülmasse und einer einzigen elektrophoretischen Bande werden mittels BLAST-Analyse charakterisiert. Aus der BLAST-Analyse sollte eine bekannte Proteinfamilie erkennbar sein, es sei denn, Varaniden besitzen neue Toxine, was den Rahmen dieser beabsichtigten Forschung sprengen würde. Dieser Ansatz hat die fortgeschrittene Sequenzierung und Analyse von Schlangengift ermöglicht (Bazaa et al., 2005, Calvete et al., 2007). ANOVAs werden durchgeführt, um festzustellen, ob es signifikante Unterschiede zwischen den in jeder der drei Arten vorhandenen Toxinen gibt.

     Weitere Analysen werden durchgeführt, um das Beutetier zu isolieren, das am stärksten vom Gift jeder Art betroffen ist, und um zu sehen, ob dies mit den Beobachtungen der natürlichen Ernährung dieser Art übereinstimmt. Dies wird durch Vergleich bekannter Schlangengiftproteine und deren Auswirkungen auf verschiedene Arten mit den Proteinen extrapoliert, die durch BLAST-Analyse in Varanidengift gefunden wurden.

     Insgesamt versuche ich, die im Varanidengift vorhandenen Proteine zu analysieren und zu sequenzieren. Ich werde auch versuchen, mögliche Verbindungen zwischen artspezifischen Toxinen, ihrer relativen Häufigkeit und den bevorzugten Beutearten der Varaniden zu analysieren.

Breitere Auswirkungen der vorgeschlagenen Arbeit

     Wenn es keine signifikante Wirkung des Varanidengiftes auf eine seiner Beutearten gibt, sind weitere Tests erforderlich, um festzustellen, welche ökologische Funktion das Gift in Waranen hat, wenn nicht, um die Prädation zu unterstützen. Einige Forscher haben argumentiert, dass es aufgrund der aggressiven physischen Natur der Varaniden-Raubtiere möglicherweise keinen ökologischen Zweck für Varaniden gibt, die Gift besitzen (Sweet, 2016). Dies ist immer noch von Bedeutung, da wir dann möglicherweise die Degeneration von energetisch teuren Giftdrüsen beobachten können. Das Testen auf antimikrobielle/antiparasitäre Eigenschaften sowie auf Verdauungsenzyme und -eigenschaften ist weitere Forschung, die unabhängig von den Ergebnissen dieser Studie durchgeführt werden muss. In Viperiden, Elapiden und Colubriden hat Gift mehrere Funktionen, daher ist es wahrscheinlich, dass Gift auch für Varanus mehrere Funktionen erfüllt.

     Wenn es eine signifikante Wirkung von Varanidengift auf einen seiner Beutetypen gibt, ist dies in mehrfacher Hinsicht signifikant. Erstens verleiht es der vorgeschlagenen Toxicofera-Klade zusätzliche Unterstützung, was darauf hindeutet, dass alle Reptilien von einem gemeinsamen giftproduzierenden Squamat-Vorfahren abstammen. Die Phylogenetik der Reptilien entwickelt sich ständig weiter, daher liefert diese Forschung weitere Beweise, um die Theorie zu stützen oder zu widerlegen. Zweitens zeigt es, dass die biochemischen oralen Sekrete von Squamaten weiterer Untersuchungen bedürfen, da erst kürzlich vorgeschlagen wurde, dass Mitglieder der Varanidae im Gegensatz zu nur mit Bakterien befallenen Mündern Gift besitzen. Drittens hat es Auswirkungen auf den Heimtierhandel, da alle Staaten Vorschriften zur privaten Haltung von Giftschlangen haben, Varaniden jedoch weniger reguliert und häufiger gehalten werden. Schließlich kann diese Forschung dazu beitragen, die Möglichkeiten der Verwendung von Varanidengift als Medizintechnik zu eröffnen. Captopril und Tirofiban sind ACE-Hemmer bzw. Thrombozytenaggregationshemmer, die aus dem Gift von Bothrops jararaca und Echis carinatus isoliert wurden. Ich glaube, dass Varanidengift auch Toxine enthalten kann, die zur Herstellung von therapeutischen Medikamenten und Pharmazeutika verwendet werden können, die das menschliche Leben verbessern.

Referenzliste

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